反相色谱柱具有硅胶和聚苯乙烯色谱柱二者的优点，并且摒弃了这两种色谱柱的缺点。以乙烯醇共聚物为基质的色谱柱，即使其载炭量很高也能保持表面的湿润。多孔结构具有足够大的平均孔径，对小分子化合物、多肽和小分子蛋白能够产生理想的分离效果。在有机溶剂比例较高的流动相中，该柱具有与硅胶基质色谱柱相同的柱效，但在碱性缓冲溶液为流动相条件下，其分离效率则超过硅胶色谱柱。显著的特点之一是基质被烷基化的填料的洗脱顺序，其保留能力与碳链长度成正比。
反相色谱柱的活化步骤：
1、应先使用20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱；
2、若流动相含有缓冲盐，用跟流动相中盐相等比例的超纯水和有机相冲洗过渡。用量为20倍柱体积，再用含缓冲盐的流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上；
3、若流动相不含缓冲盐，用流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上；
4、到压力基线平稳，若不平稳可延长平衡时间。
优化反相色谱柱的条件：
在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据目标决定的。如果要开发质量控制方法，您可能会需要像等度分离这种可变因素较少的方法。如果目标是得到较高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱使所有组分都得到较大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多保留不同的目标化合物的复杂样品，用等度分离可能不能解决问题，应开发并优化梯度方法。
按约定俗成将水相溶剂和反相色谱中较弱的溶剂称为流动相“A”，“B”溶剂是有相组成较高和较强的溶剂。在反相色谱模式中，当增加B的百分比时，通常保留将减少。请注意，在还没有开发出样品的实际分析方法前，大部分人开发HPLC方法都是采用“反复实验”的方法，即，尝试各种不同流动相条件，以找出较佳条件。
